【中性蛋白酶】酶的浓度胰蛋白酶一般为0.1%-0.25%(活力1:

200或1:

250)但是，遇到难以消化的组织时，浓度会适度提高，消化时间会适度延长。

浓度高对细胞有毒性，但浓度低的胰蛋白酶在培养液中促进细胞增殖。【中性蛋白酶】向培养液中加入血清后，其少量胰蛋白酶被血清中的抗胰蛋白酶因子除去。温度被认为是胰蛋白酶在56时活性最强，【中性蛋白酶】但由于细胞受损，所以不能采用，常用的温度是37，通常在37下消化比室温作用更快。

pH pH8~pH9是胰蛋白酶活性的适当范围，【中性蛋白酶】但随着碱性的增加，其活性也减少，活性强分散快，细胞也容易被消化，在消化分离细胞时PH只能在7.6~8.0之间选择，否则会对细胞造成损伤。无机盐离子用含有钙和镁的盐类溶液制备胰蛋白酶时，【中性蛋白酶】具有抑制胰蛋白酶消化的作用。因此，调制时使用无钙镁离子的PBS进行。

消化时间细胞的消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，影响细胞的代谢。【中性蛋白酶】一般的消化时间20分钟比较合适。冷消化时使用低浓度消化液，也可以在4下过一晚。分离方法如下。

一晚冷消化将取得的组织用Hanks液清洗3次，碎片大小切成4毫米左右，【中性蛋白酶】用Hanks液清洗2~3次，除去血细胞和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，边摇晃边在4过夜，第二天用Hanks液

多次提取消化法多次提取消化法有以下3种。

热消化多重提取0.25%胰蛋白酶37水浴切断的细胞块消化15~20分钟，【中性蛋白酶】清洗后用营养液分散，制成细胞悬浊液，以适当的浓度瓶培养，将残留的未消化组织如上述方法那样操作，消化提取细胞。

冷消化多次提取--方法相同，但消化温度为4。先热消化后冷消化--用胰蛋白酶在37消化组织块20分钟清洗后，用营养液分散制成悬浊液，清洗剩下的未消化的小组织块后，用胰蛋白酶在4过夜，次日提取细胞，【中性蛋白酶】分散在悬浊液中，用瓶子培养。胶原酶消化法胶原酶是从细菌中提取的酶，对胶原有很强的消化作用。

适合消化纤维性组织、上皮组织及癌组织，对细胞间质有良好的消化作用，对细胞本身影响不大，能使细胞和胶原蛋白成分脱离。

该酶分离效果良好，即使存在钙、镁离子也是活性的，因此可以用含有PBS和血清的培养液制备，【中性蛋白酶】操作简便，可以提高细胞的成活率，最终浓度为200u/mL或0.1~0.3 MG。这种酶的消化作用得到缓和，不需要机械振动。被胶原酶消化的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐性，有些上皮细胞块可能没有被完全消化。

成为小块的上皮细胞比分散的各个上皮细胞更容易生长，因此不需要进一步消化处理。