01

为什么DH5生长缓慢/有小斑点？

原因：

(1)DH5感受态细胞生长缓慢；

(2)细菌溶液过多，菌落过多，导致菌落/小菌落生长缓慢。

方案：

(1)延长细菌的生长时间；

(2)建议减少菌液的涂布量，剩余菌液可在4下保存，观察细菌生长状况后决定是否停留。

02

DH5和DH5有什么区别？

DH5需要IPTG和X-Gal一起用于筛选蓝色和白色斑点。

DH5-可以在没有IPTG的情况下用X-Gal进行筛选。

03

Mach1T1或Turbo，哪个增长更快？

涡轮

04

细菌如何获得抗噬菌体的特性？

(1)吸附抑制：细菌表面受体蛋白结构的改变、受体的丢失、产物的竞争性抑制等。

(2)防止噬菌体脱氧核糖核酸的注射；

(3)噬菌体脱氧核糖核酸的降解或干扰；

(4)流产感染。

05

DB3.1细胞如何扩增含ccdB的自杀基因？

ccdB蛋白的毒性作用是通过与gyrase GyrA亚单位的氨基酸462结合，DNA在断裂后无法修复，DNA合成受阻，导致细胞死亡。

DB3.1菌株的细胞含有GyrA462基因，该基因能表达gyrA亚单位蛋白与ccdB的结合区，并能竞争性抑制ccdB蛋白的活性，使gyrA酶能正常发挥作用，实现含ccdB载体的正常扩增。

06

从JM110细胞制备的质粒能用于基于Dpn消化的点突变试剂盒吗？

不行。JM110是一个缺失甲基化基因dam和dcm的突变体。JM 110扩增的质粒不能甲基化，而点突变试剂盒中的Dpn可以消化甲基化的模板质粒。

注意：

(1)基于Dpn消化的打点试剂盒以甲基化载体质粒为模板，设计一对打点引物进行扩增；

(2)用Dpn消化甲基化模板质粒；

(3)聚合酶链反应扩增片段未甲基化，不能被Dpn消化降解。

(4)将Dpn消化产物转入感受态细胞。

07

大肠杆菌中质粒甲基化的类型是什么？什么方法可以用来去甲基化？用什么方法来验证质粒已经去甲基化？JM110能用来制备大量的质粒吗？

两种，Dam和Dcm(Dam甲基化酶可以甲基化GATC序列中的腺嘌呤N6位点，Dcm甲基化酶可以甲基化CCAGG和CCTGG序列中的胞嘧啶C5位点)。

质粒可以转化到JM110感受态细胞中，实现质粒的去甲基化。

xba消化可用于验证质粒是否去甲基化。

不，JM110转化效率低，不能甲基化质粒，容易引起突变。

08

stbl3和stbl4之间有什么区别(菌株来自哪个公司)？哪种质粒适合构建？

区别：(Stbl3和Stbl4菌株来自invitrogen公司)Stbl3为链霉素抗性菌株，Stbl4为四环素抗性菌株。Stbl4的增长速度比Stbl3慢。

该方法适用于构建逆转录病毒或慢病毒质粒，即具有5’-LTR和3’-LTR结构的质粒，如pLV-Flag质粒。

09

蓝白色斑点的筛选原则是什么？

(1)蓝白色斑点的筛选条件是带有LacZ编码区的载体可以与宿主细胞(如Mach1-T1、TOP10、DH5、JM109、DH10B和NEB10-等)联合使用。)可以互相补充。

(2)一些载体具有LacZ基因的编码区，其可以编码LacZ蛋白的N末端片段(该编码区包含多个克隆位点，允许插入外源基因)。宿主细胞只能编码LacZ蛋白的C端区，由载体和宿主单独产生的LacZ片段没有-半乳糖苷酶活性。

(3)当载体进入宿主细胞时，载体的片段和宿主的片段是互补的，互补产生的-半乳糖苷酶是活性的。在IPTG和X-Gal的出现下，殖民地变成了蓝色。

(4)然而，当外源基因插入载体中LacZ 的编码区时，LacZ片段的正常表达被破坏，因此它不能与宿主细胞-互补，因此在IPTG和X-Gal存在下菌落是白色的。

10

DH10B和DH10Bac有什么区别？

DH10B是克隆感受态细胞，可用于大质粒(8 kb)转化。

DH10Bac是用于昆虫杆状病毒的Bac-Bac系统中同源重组的菌株，其可用于转化pFastBac系列质粒(如pFastBacl和pFastBacDual)。感受态细胞含有Bacmid和用于重组质粒的辅助质粒。

11

BL21和BL21(DE3)有什么区别，DE3代表什么基因？

BL21(DE3)将T7核糖核酸聚合酶基因整合到BL21菌株的基因组中，适合T7系统表达(带有T7启动子)。

DE3是一种能够表达T7核糖核酸聚合酶的序列，通过溶源性噬菌体整合到细菌基因组中。

12

BL21(DE3)和T7表达菌的区别是什么？

T7表达菌株来源于BL21菌株。T7表达菌株与BL21(DE3)的主要区别在于T7表达菌株的T7核糖核酸聚合酶基因整合在菌株基因组的Lac操纵子区，具有抗T1噬菌体感染的特性。BL21(DE3)菌株中的T7核糖核酸聚合酶基因来源于噬菌体裂解法，并含有噬菌体成分。

13

应该选择什么样的感受态细胞来表达含有稀有密码子的基因，这些细胞的表达原理是什么？

罗塞塔(DE3)

Rosetta(DE3)有一个具有氯霉素抗性的质粒，它可以补充六个稀有密码子的tRNA(精氨酸精氨酸精氨酸：aagaagg，异亮氨酸Ile I: AUA，脯氨酸Pro P CCC，亮氨酸Leu L:CUA，甘氨酸甘氨酸甘氨酸G:GGA)。

14

当BL21(DE3)细胞用于蛋白质表达时，细胞一被诱导就死亡。我可以用什么方法来解决这个问题？

可以使用表达BL21(DE3)普利斯或T7普利斯的菌株。

15

普利西和普利斯有什么不同？

pLysY表达的T7溶菌酶保留了对T7RNA聚合酶的抑制作用，但失去了细胞壁水解的酰胺酶活性，从而避免了诱导过程中的细胞裂解。

pLysS表达的T7溶菌酶具有完全的活性。

16

哪种感受态细胞更适合含有二硫键的蛋白质？

原始抗体(DE3)或洗牌T7-K12和洗牌T7-B.

17

什么样的感受态细胞被用来增加表达蛋白的可溶性表达？

原始抗体(DE3)或洗牌T7-K12和洗牌T7-B.

18

使用OrigamiB(DE3)感受态细胞时应该注意什么？

OrigamiB(DE3)感受态细胞对卡那霉素和四环素有抗性，因此转化的质粒不能对卡那霉素或四环素有抗性。

19

手册上说这个XL10-Gold细胞有四环素和氯霉素抗性，我的质粒是氨苄青霉素抗性。当转化这个质粒时，我需要添加四环素和氯霉素抗生素吗？

不，四环素和氯霉素在该菌株的基因组中稳定存在，因此不需要添加这两种抗生素。