关于感受态细胞,你不可不知的那些事儿~

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关于感受态细胞,你不可不知的那些事儿~

2020-07-20币圈百科4405

01

为什么DH5生长缓慢/有小斑点?

原因:

(1)DH5感受态细胞生长缓慢;

(2)细菌溶液过多,菌落过多,导致菌落/小菌落生长缓慢。

方案:

(1)延长细菌的生长时间;

(2)建议减少菌液的涂布量,剩余菌液可在4下保存,观察细菌生长状况后决定是否停留。

02

DH5和DH5有什么区别?

DH5需要IPTG和X-Gal一起用于筛选蓝色和白色斑点。

DH5-可以在没有IPTG的情况下用X-Gal进行筛选。

03

Mach1T1或Turbo,哪个增长更快?

涡轮

04

细菌如何获得抗噬菌体的特性?

(1)吸附抑制:细菌表面受体蛋白结构的改变、受体的丢失、产物的竞争性抑制等。

(2)防止噬菌体脱氧核糖核酸的注射;

(3)噬菌体脱氧核糖核酸的降解或干扰;

(4)流产感染。

05

DB3.1细胞如何扩增含ccdB的自杀基因?

ccdB蛋白的毒性作用是通过与gyrase GyrA亚单位的氨基酸462结合,DNA在断裂后无法修复,DNA合成受阻,导致细胞死亡。

DB3.1菌株的细胞含有GyrA462基因,该基因能表达gyrA亚单位蛋白与ccdB的结合区,并能竞争性抑制ccdB蛋白的活性,使gyrA酶能正常发挥作用,实现含ccdB载体的正常扩增。

06

从JM110细胞制备的质粒能用于基于Dpn消化的点突变试剂盒吗?

不行。JM110是一个缺失甲基化基因dam和dcm的突变体。JM 110扩增的质粒不能甲基化,而点突变试剂盒中的Dpn可以消化甲基化的模板质粒。

注意:

(1)基于Dpn消化的打点试剂盒以甲基化载体质粒为模板,设计一对打点引物进行扩增;

(2)用Dpn消化甲基化模板质粒;

(3)聚合酶链反应扩增片段未甲基化,不能被Dpn消化降解。

(4)将Dpn消化产物转入感受态细胞。

07

大肠杆菌中质粒甲基化的类型是什么?什么方法可以用来去甲基化?用什么方法来验证质粒已经去甲基化?JM110能用来制备大量的质粒吗?

两种,Dam和Dcm(Dam甲基化酶可以甲基化GATC序列中的腺嘌呤N6位点,Dcm甲基化酶可以甲基化CCAGG和CCTGG序列中的胞嘧啶C5位点)。

质粒可以转化到JM110感受态细胞中,实现质粒的去甲基化。

xba消化可用于验证质粒是否去甲基化。

不,JM110转化效率低,不能甲基化质粒,容易引起突变。

08

stbl3和stbl4之间有什么区别(菌株来自哪个公司)?哪种质粒适合构建?

区别:(Stbl3和Stbl4菌株来自invitrogen公司)Stbl3为链霉素抗性菌株,Stbl4为四环素抗性菌株。Stbl4的增长速度比Stbl3慢。

该方法适用于构建逆转录病毒或慢病毒质粒,即具有5’-LTR和3’-LTR结构的质粒,如pLV-Flag质粒。

09

关于感受态细胞,你不可不知的那些事儿~

蓝白色斑点的筛选原则是什么?

(1)蓝白色斑点的筛选条件是带有LacZ编码区的载体可以与宿主细胞(如Mach1-T1、TOP10、DH5、JM109、DH10B和NEB10-等)联合使用。)可以互相补充。

(2)一些载体具有LacZ基因的编码区,其可以编码LacZ蛋白的N末端片段(该编码区包含多个克隆位点,允许插入外源基因)。宿主细胞只能编码LacZ蛋白的C端区,由载体和宿主单独产生的LacZ片段没有-半乳糖苷酶活性。

(3)当载体进入宿主细胞时,载体的片段和宿主的片段是互补的,互补产生的-半乳糖苷酶是活性的。在IPTG和X-Gal的出现下,殖民地变成了蓝色。

(4)然而,当外源基因插入载体中LacZ 的编码区时,LacZ片段的正常表达被破坏,因此它不能与宿主细胞-互补,因此在IPTG和X-Gal存在下菌落是白色的。

10

DH10B和DH10Bac有什么区别?

DH10B是克隆感受态细胞,可用于大质粒(8 kb)转化。

DH10Bac是用于昆虫杆状病毒的Bac-Bac系统中同源重组的菌株,其可用于转化pFastBac系列质粒(如pFastBacl和pFastBacDual)。感受态细胞含有Bacmid和用于重组质粒的辅助质粒。

11

BL21和BL21(DE3)有什么区别,DE3代表什么基因?

BL21(DE3)将T7核糖核酸聚合酶基因整合到BL21菌株的基因组中,适合T7系统表达(带有T7启动子)。

DE3是一种能够表达T7核糖核酸聚合酶的序列,通过溶源性噬菌体整合到细菌基因组中。

12

BL21(DE3)和T7表达菌的区别是什么?

T7表达菌株来源于BL21菌株。T7表达菌株与BL21(DE3)的主要区别在于T7表达菌株的T7核糖核酸聚合酶基因整合在菌株基因组的Lac操纵子区,具有抗T1噬菌体感染的特性。BL21(DE3)菌株中的T7核糖核酸聚合酶基因来源于噬菌体裂解法,并含有噬菌体成分。

13

应该选择什么样的感受态细胞来表达含有稀有密码子的基因,这些细胞的表达原理是什么?

罗塞塔(DE3)

Rosetta(DE3)有一个具有氯霉素抗性的质粒,它可以补充六个稀有密码子的tRNA(精氨酸精氨酸精氨酸:aagaagg,异亮氨酸Ile I: AUA,脯氨酸Pro P CCC,亮氨酸Leu L:CUA,甘氨酸甘氨酸甘氨酸G:GGA)。

14

当BL21(DE3)细胞用于蛋白质表达时,细胞一被诱导就死亡。我可以用什么方法来解决这个问题?

可以使用表达BL21(DE3)普利斯或T7普利斯的菌株。

15

普利西和普利斯有什么不同?

pLysY表达的T7溶菌酶保留了对T7RNA聚合酶的抑制作用,但失去了细胞壁水解的酰胺酶活性,从而避免了诱导过程中的细胞裂解。

pLysS表达的T7溶菌酶具有完全的活性。

16

哪种感受态细胞更适合含有二硫键的蛋白质?

原始抗体(DE3)或洗牌T7-K12和洗牌T7-B.

17

什么样的感受态细胞被用来增加表达蛋白的可溶性表达?

原始抗体(DE3)或洗牌T7-K12和洗牌T7-B.

18

使用OrigamiB(DE3)感受态细胞时应该注意什么?

OrigamiB(DE3)感受态细胞对卡那霉素和四环素有抗性,因此转化的质粒不能对卡那霉素或四环素有抗性。

19

手册上说这个XL10-Gold细胞有四环素和氯霉素抗性,我的质粒是氨苄青霉素抗性。当转化这个质粒时,我需要添加四环素和氯霉素抗生素吗?

不,四环素和氯霉素在该菌株的基因组中稳定存在,因此不需要添加这两种抗生素。

标签: 四环素
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